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量身打造!RNA-Capseq更适合临床融合基因检测 | 经典文献分享
时间:2019年06月26日 来源:测序中国 作者:测序中国
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基因融合或易位可能产生功能改变的嵌合蛋白,也可能重新排列基因启动子,通过激活原癌基因或抑制抑癌基因导致细胞信号通路紊乱,它们在肿瘤的发生过程中扮演着重要的角色。[1,3] 例如,BCR–ABL1融合会导致酪氨酸激酶活性以及下游PI3K和MAPK信号通路的组成型激活,使细胞逃避凋亡,实现无限增殖。

图1. 基因融合致癌机制[1,3]

50多年前,BCR-ABL1融合首次在慢性粒细胞白血病中被发现。除血液恶性肿瘤外,技术的进步使得基因融合也在许多实体瘤中得以发现,包括甲状腺癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌和肾癌等。特别是下一代测序(NGS)的出现,从根本上改变了癌症基因融合的发掘模式。在目前已报道的近10,000个基因融合中,有90%是通过NGS方法鉴定,包括DNA测序(DNA-seq)和RNA测序(RNA-seq)。通过对TCGA中代表13种肿瘤类型的4300个原发肿瘤样本的转录组数据分析发现,有7%的样本存在框内激酶融合。更重要的是,可用药的激酶融合在检测的单个癌症类型中检测到的频率为1%~9%,包括ALK、ROS1、RET、NTRKsFGFR(图2)。

图2. 融合基因在不同癌症中的分布[1,4]

随着精准医疗进程的深入,融合基因靶向药物种类和适应症正在不断增加, ALKROS1被证明是治疗非小细胞肺癌的有效靶点。此外,RET、NTRK1BRAF重排已在临床上成功用于靶向治疗。例如,针对NTRK融合突变的泛癌种靶药Vitrakvi(larotrectinib)已获得FDA批准由Roche公司开发的“不限癌种”个体化药物Rozlytrek(entrectinib)也获得日本厚生劳动省(MHLW)批准,用于治疗携带NTRK基因融合的晚期复发实体瘤患者。虽然携带融合基因靶点的患者比例较低,但由于癌症人群基数大,可能获益的患者数量仍然可观。因此,快速、准确、全面的鉴定融合基因谱可以为患者带来更优的医疗决策。

表1. FDA批准的融合基因靶向药(部分)

目前,融合基因诊断主要包括荧光原位杂交(FISH)、RT-PCR等方法。虽然这些方法灵敏度高,但通常只检测单个融合基因的存在,诊断过程漫长、且费用昂贵。此外,这些方法不能识别新的融合基因伴侣或解决复杂的结构重排,这也是导致假阴性结果的主要原因[5]。

理想的融合基因临床检测应具备以下特点:

1)能够耐受低质量RNA样本,比如FFPE RNA;

2)具有更高的灵敏度,能够应对低表达的融合基因或正常细胞转录本的稀释;

3)可以一次检测多个基因,且具有发现新融合亚型的能力,因为融合基因伴侣的数量多、融合位点复杂多变(图3);

4)成本较低,患者能够承担,同时节约公共医疗资源;

5)具有良好的技术拓展性,根据临床研究和药物研发的新进展,可快速更新迭代,适应临床需求。

图3. 融合基因亚型较多 [3,4]

RNA-seq也分为全转录组测序和靶向转录组测序。在科研中,尽管全转录组RNA-seq(poly(A)和去核糖体)展现出广泛的潜力,但由于其样本质量耐受度低、成本高,并不适合用于个体患者的常规临床检测。具体而言,poly(A)RNA-seq在对降解的RNA样本测序时,偏好覆盖转录本3’端,融合位点离3’端越远便越难检测。如图4所示,BCR-ABL融合位点距离ABL1转录本3’端5.3Kb,仅当RIN值下降到7时,断裂位点附近已经没有Reads覆盖。当RIN值低于4时,poly(A)RNA-seq对融合基因检测的灵敏度已经降至50%左右[6]。换言之, RNA-seq poly(A)的融合基因检测灵敏度严重依赖于RNA样本的完整程度。

图4. poly(A)RNA-seq对转录本覆盖依赖RNA样本完整度[5,6]

此外,去核糖体RNA-seq(下文简称RD-RNA-seq)虽然可以获得更为完整的转录本,但RD-RNA-seq测序成本较高,主要是由于编码区数据占比较少,rRNA去除效果不稳定,同时还存在原核RNA污染的风险。

图5. poly(A)RNA-seq和RD-RNA-seq数据分布示意图

与DNA-seq一样,在RNA-seq中也有两类靶向测序方法,分别基于PCR和杂交捕获(下文简称RNA-Capseq)。PCR靶向测序有一定的局限性,无法事先明确融合基因和断裂位点。尽管有报道通过锚定PCR技术进行了优化,但该技术本身的拓展性仍然不如RNA-Capseq [7]。2009年,Levin等人首次利用RNA-Capseq从肿瘤样本的cDNA文库中捕获467个肿瘤相关基因,具有较高的特异性,能够发现新的嵌合转录本,并同时分析转录本表达[8]。2011年,Mercer等人证实RNA-Capseq在低丰度转录本的分析中具有明显优势。2014年,Mercer团队进一步对RNA-Capseq技术进行了系统升级,RNA起始量降低30倍,从3μg下调为100ng。如图6所示,在低质量FFPE RNA样本中,RNA-Capseq对转录本的测序深度和覆盖均一性均明显优于poly(A)RNA-seq。研究人员很快意识到, RNA-Capseq更加适合临床样本的融合基因检测。

图6. 基于杂交捕获的RNA-Capseq可耐受高挑战样本[9,10]

与WGS适用于NIPT一样,RNA-Capseq可谓是为融合基因检测量身打造,具有耐受低质量RNA样本、高灵敏度、高基因通量以及Panel易于延伸拓展等优势。如图7所示,其检测原理是根据覆盖融合位点附近的嵌合Reads来预测融合的发生。

图7. RNA-Capseq检测融合基因示意图[11,12]

因此,近年来,RNA-Capseq已被建议作为实体瘤和血液肿瘤的融合基因诊断方法 [12,13]。2016年,He等人验证了RNA-Capseq在血液恶性肿瘤融合基因检测中的表现。2017年,Reeser工作小组验证了RNA-Capseq在实体瘤融合基因检测中的性能,该方法对93个激酶和转录因子基因的完整转录本进行了检测。在74个阳性和36个阴性对照样本中,RNA-Capseq融合检测的敏感度为93.3%,特异性为100%。将该方法应用于前瞻性患者样本,发现OLFM4作为新的RET融合伴侣,并在一名前列腺癌患者中发现KLK2-FGFR2融合,该患者随后接受了泛成纤维细胞生长因子受体抑制剂的治疗。除融合检测外,该方法还可以提供基因表达分析、单核苷酸变异检测和选择性剪接识别等多种分析。


图8. RNA-Capseq应用于临床融合基因诊断[12,13]

经典文献分享

最后,再给大家分享一篇经典的关于RNA-Capseq应用于肿瘤融合基因检测的文献。研究小组在细胞系和人工标准品中,对采用实体瘤和血液肿瘤2种Panel的RNA-Capseq方法进行了实验和信息分析优化。随后,对该方法进行回顾性验证(n=72),结果显示,其融合基因诊断率较传统方法提高13%。此外,该研究还进一步尝试采用RNA-Capseq分析免疫组库,全面呈现了RNA-Capseq改善临床融合基因检测的巨大潜力

图9. RNA-Capseq应用于血液和实体瘤癌症的融合基因诊断[11]

1. 实验方法


文库构建和杂交捕获:细胞系和临床样本RNA投入量分别为4μg和100-1000ng,预文库构建和杂交捕获分别采用Roche KAPA链特异文库构建试剂盒(#07277261001)和Roche杂交捕获试剂盒SeqCap EZ Accessory Kit v2 #07 145 594 001; SeqCap EZ Developer Enrichment Kit #06 471 684 001; SeqCap EZ Hybridisation and Wash Kit #05 634 261 001)。

探针设计及合成:经验根据文献和公开数据库选择目标基因,鉴于Roche探针的超多重叠瓦设计、融合基因探针设计算法以及积累多年的探针数据库等优势,从Roche合成实体瘤和血液肿瘤Panel探针(探针基因组成如图9所示)

2. RNA-Capseq数据表现


On-target为~ 50%(一次捕获)和93%(二次捕获),血液肿瘤Panel的On-target略高于实体瘤Panel(中位数99.3 v 94.7,)。更为重要的是,FFPE与新鲜冷冻组织(FFT)的On-target无显著差异,表明即使是具有挑战性的FFPE组织也可以通过RNA-Capseq进行靶向富集。两种Panel的转录本覆盖均匀性良好。此外,血液肿瘤和实体瘤Panel对已知剪接位点的覆盖分为77.8和84.6%。以上研究结果表明, RNA-Capseq中的两种Panel均具有检测大部分基因易位的能力(图10)。

图10. 血液和实体瘤Panel的RNA-Capseq数据表现

3. 融合基因检测


在评估了多个融合基因分析工具后,研究人员最终确认STARfusion和Fusioncatcher两种算法同时检测到融合基因作为判定条件。RNA-Capseq成功检测到6个细胞系中所有的已知融合基因。值得注意的是,RNA-Capseq检测融合基因并不需要同时靶向两个融合基因伴侣(图11 d),表明RNA-Capseq捕获和识别新的非靶向融合伴侣的能力。更为重要的是, RNA-Capseq在检测低丰度融合基因时,较标准RNA-seq具有明显的优势。例如,在BCR-ABL1融合基因的检测时(8-24 DNA拷贝-K562),两种方法没有明显差异;当检测EWSR1 - FLI1融合基因时(单个DNA拷贝-RDES),标准RNA-seq对融合位点已经没有reads覆盖,说明靶向富集对于低丰度融合基因检测具有独特的优势(图11 b)。

图11. d. 人工合成标准品投入量与融合位点Reads相关性散点图;b. RNA-Capseq与标准RNA-seq对不同表达量的融合基因的融合位点覆盖情况。

4. 基因表达检测


采用3x3x3(3 Sample;3 Cap;3 Seq Lane)方式评估RNA-Capseq对临床样本基因表达检测的重现性。实验结果表明,批内和批间重复稳定,平均变异系数分别为0.073和0.071。此外,聚类分析结果也表明基因表达检测的高重复性。有趣的是,较内源融合伴侣,基因融合后往往出现更高的表达,例如,与未融合的EZRROS1基因相比,EZR-ROS1融合基因表达量较高,暗示还存在其他调控方式 (图12 A)。更为重要的是,即便RNA-Capseq不能直接检测到融合不同基因上游启动子的染色体重排,但它仍可能检测到由此导致的基因表达变化。例如,在一个RNA-Capseq无法确认融合基因的肉瘤患者中,先前的诊断结果为ROS1染色体重排,RNA-Capseq表达量分析显示,ROS1表达式是其他肉瘤样本的50倍 (图12 B)。

图12. A. EZR-ROS1融合基因的表达量明显高于未融合的EZR和ROS1基因;B. 启动子易位导致ROS1高表达量。

5. 免疫组库分析


由于一系列血液肿瘤中涉及IG/TCR受体基因座的融合基因,因此该研究也在血液Panel中加入了针对V、J和C外显子的探针(图13 a),并利用血液Panel在患者队列中确认了3例携带IGH-MYCIGH-BCL6融合基因的淋巴瘤患者。除了融合基因检测,这些探针还捕获了免疫受体表达的转录本(图13 a)。接下来,研究人员还评估了血液Panel在细胞系和临床样本中解析免疫组库的能力。在临床队列的32例血液病患者样本(29例癌变和3例健康)中,大多数肿瘤和正常样本表达了数百种不同的免疫受体克隆型,每个克隆都有少量的reads(图13 b)。在骨髓样本中, IG克隆比TCR克隆更多,反映了骨髓中成熟B细胞的多样性(图13 b)。值得注意的是,在29个肿瘤样本中,有2例的T/BCR克隆数远多于其他样本(10x/100x),这可能反映了恶性T细胞和b细胞克隆群的存在(图13 b)。

图13. a. TCR/BCR 探针设计示意图 b. 用MiXCR对细胞系和临床患者样本中的免疫受体克隆型进行定量

总 结

产生融合基因的染色体易位是导致癌症的重要原因,其准确诊断对有效治疗至关重要。然而,传统方法,如FISH和RT-PCR依赖于先验数据库,通量和分辨率较低。因此,通常只针对最常见的融合基因,可能需要反复检测,并极有可能导致治疗延误或误诊。

与此前的技术相比,RNA-Capseq能够在一次检测中评估数百个基因,提供高分辨率的融合基因检测,能够同时识别已知和新的融合基因。虽然NGS检测流程较长,但这种多基因“宽度”可以缩短诊断时间,同时提高诊断率。鉴于这些优点,RNA-Capseq越来越多地被用于融合基因的诊断。

图14. 多种融合基因检测技术路线对比图

然而,尽管RNA-Capseq的高通量特性为癌症诊断提供了更广泛的途径,但事实上,假阳性率较高仍是我们面临的一个重大挑战。但我们相信,随着技术的不断完善,RNA-Capseq将为患者提供更细致的治疗和预后措施,为患者提供更好的护理。

参考文献

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3. Gao, Q. , et al. "Driver Fusions and Their Implications in the Development and Treatment of Human Cancers. " Cell Reports23.1(2018):227.

4.Yoshihara, K , et al. "The landscape and therapeutic relevance of cancer-associated transcript fusions." Oncogene (2014)

5. Gocke, C. D. et al. Risk-based classification of leukemia by cytogenetic and multiplex molecular methods: results from a multicenter validation study.Blood Cancer J. 2, e78 (2012).

6. Davila, Jaime I. , et al. "Impact of RNA degradation on fusion detection by RNA-seq." BMC Genomics 17.1(2016):814-.

7. Zheng, Zongli , et al. "Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing." Nature Medicine 20.12(2014):1479-1484.

8. Levin, Joshua Z , et al. "Targeted next-generation sequencing of a cancer transcriptome enhances detection of sequence variants and novel fusion transcripts." Genome biology 10.10(2009).

9. Mercer, Tim R , et al. "Targeted RNA sequencing reveals the deep complexity of the human transcriptome." Nature Biotechnology 30.1(2011):99-104.

10. Mercer, Tim R , et al. "Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq." Nature Protocols.  Cabanski, Christopher R. , et al. "cDNA Hybrid Capture Improves Transcriptome Analysis on Low-Input and Archived Samples." The Journal of Molecular Diagnostics 16.4(2014):440-451.

11. Heyer et al. Diagnosis of fusion genes using targeted RNA sequencing. Nature communication (2019)

12. Reeser, Julie W. , et al. "Validation of a Targeted RNA Sequencing Assay for Kinase Fusion Detection in Solid Tumors." The Journal of Molecular Diagnostics(2017):S1525157817301149.

13. He, Jie , et al. "Integrated genomic DNA/RNA profiling of hematologic malignancies in the clinical setting." Blood 127.24(2016):3004.